Rodina neúnavných počítaček buněk Luna a Quantom

20.07.2018 10:42

Koncentrace a životaschopnost buněk ve vzorku je rozhodující parametr pro mnoho diagnostických technik a biotechnologických procesů.  Ať už pracujete s bakteriemi, kvasinkami nebo lidskými buňkami, musíte mít jistotu, že počet buněk je přesný a není ovlivněný faktory jako:

 
 
  • Shlukováním (clustering)

  • Kontaminací jinými buňkami (např. červené krvinky)

  • Lidskou chybou

  • Statisticky malým počtem

Jak se počítají buňky?

Mezi běžné procesy počítání buněk v kultuře patří

  • Hemocytometrie („Sklíčko“ + Mikroskop)
  • Kultivace ze sériového ředění a počítání kolonií
  • Průtoková cytometrie (Laser, Coulter)
  • Obrazová analýza (světlé pole, fluorescenční)

Při hemocytometrii, kterou většina z nás zná z praktik, se roztok buněk pipetuje do speciálního kalibrovaného sklíčka s rastrem a pod mikroskopem se jednotlivé buňky s pomocí ručního počítadla spočítají. Je to tradiční metoda a pořizovací náklady na sklíčko nejsou vysoké, na druhou stranu nevýhody jsou

  • Lidská chyba – dvojté počítání, kontaminace
  • Malé množství vzorku – distribuce není homogenní
  • Neurčí snadno životaschopnost buněk – subjektivní vnímání barvy
  • Cena kvalifikované lidské práce

 

Kultivace je metoda na určení životaschopných buněk, kdy se sériově ředěný roztok asepticky nanese na Petriho misky s vhodným agarem a po inkubaci se spočítají kolonie. Ideální je spočítat více než jedno naředění a regresí se dostat ke konečné koncetraci.  I když je metoda stále oblíbená v mnoha laboratořích, a umožňuje také selekci buněk například po transfekci a bázi antibiotik je:

  • Časově náročná kvůli růstu kolonií
  • Materiálově nákladná
  • Nedokáže určit počet neživotaschopných buněk
  • Malé počty buněk a lidská chyba.
  • Nepoužitelná na nekultivovatelné organizmy

Mezi hlavní silné stránky průtokové cytometrie  patří rozhodně statisticky signifikantní vzorek buněk a možnost automatizace procesu. Jelikož se metoda nespoléhá na oči, ale na světelný paprsek nebo elektrody (Coulterova metoda), je osvobozena od lidské chyby. Na druhou stranu

  • Nerozliší mrtvou a živou buňku, nečistotu nebo shluk, data se těžko ověřují
  • Mikrofluidika vyžaduje pečlivou údržbu, aby se neucpala

Obrazová analýza (image analysis) kombinuje silné stránky tradiční hemocytometrie jako schopnost rozlišení s automatizací a nestranností počítače. Automatické počítače tak dokážou analyzovat za minutu tisíce buněk, změřit jejich velikost a pomocí de-clustering algoritmu započítat i shlukované buňky. Pokud máte pochyby o správnosti dat, můžete uložené obrázky navštívit a revidovat. Přístroje Luna si získaly mnoho příznivců, a oblíbená Luna se začíná pomalu nahrazovat Lunou II

 
   


Při použití barviv Acridine Orange (AO) a Propidium Iodide (PI), které se vážou na nukleové kyseliny je možné jak rozlišit živé buňky od mrtvých, tak buňky od nečistot nebo bezjaderných buněk (červené krvinky). Přístroje Luna FL a Stem pořídí fotografie ve světlém poli a ve dvou kanálech fluorescence a všechny tři kanály proloží. AO, která barví DNA jak živých tak mrtvých buněk vytváří zelenou fluorescenci. PI barví DNA pouze v mrtvých buňkách bez integrální membrány,  které se díky utlumení zelené fluorescence jeví oranžové. „Buňky“ bez fluorescence jsou buď bez nukleové kyseliny, nebo jsou pouze nečistotami. Z jednoho počítání tak získáte informace jak o životaschopnosti, tak o míře znečištění vašeho vzorku.

Přístroje Luna se dají použít jak s jednorázovými sklíčky z PS nebo PMMA (photon slides), které netrpí autofluorescencí, tak se sklíčky z optického skla na opakované použití.

 

Řada Luna jsou výborné a cenově dostupné přístroje na práci s eukaryotickými buňkami, ale z důvodu omezeného zvětšení se nehodí na počítání bakterií. Tento segment trhu je vyplněn přístrojem Quantom Tx, který funguje pouze ve fluorescenčním módu. Počítání bakterií tvoří hned několik překážek. Jednak malé rozměry a malý genom, který absorbuje menší množství fluorescenčního barviva a jeví se méně jasný, tak tendence agregovat se nebo růst ve vláknitých či řetízkovitých strukturách.

 

 

Quantom Tx je set počítadla a speciálně navržené centrifugy. Po dvacetiminutové inkubaci vzorku s proprietárním barvivem, vyvinutým pro tuto aplikaci se 5ul vzorku pipetuje do sklíčka z PMMA, které se vloží na 10 minut do centrifugy, což zajistí sedimentaci vzorku na sklíčko.  Po vložení do přístroje je za minutu hotovo, už je jen na uživateli jaký analytický algoritmus vybere.

 

Automatizujte počítání buněk a zeptejte se našich produktových specialistů na detaily těchto přístrojů.  

 

Zpět